Glukagon wytwarzany w komórkach A wysp trzustkowych jest pojedynczym łańcuchem peptydowym, liczącym 29 aminokwasów. W przeciwieństwie do insuliny, w jego cząsteczce nie ma cysteiny, proliny i izoleucyny, zawiera ona natomiast tryptofan, co ma znaczenie w badaniach histochemicznych. Masa cząsteczkowa przedstawionego na ryc. 71 glukagonu wieprzowego wynosi 3485. Taką samą budowę ma glukagon ludzki, wołowy, szczura, królika, a prawdopodobnie wszystkich ssaków. Bardzo nieduża (1—2 aminokwasy) jest też różnica budowy pomiędzy glukagonem ssaków t innych gromad (ptaków, ryb). Utrzymanie nie zmienionej struktury przez wiele szczebli rozwoju filogenetycznego wskazuje na specjalne znaczenie tego hormonu w procesie ewolucji. Punkt izoelektryczny glukagonu przypada na odczyn obojętny (insuliny na odczyn kwaśny). Struktura przestrzenna glukagonu, który jest stosunkowo prostym peptydem o nie zawiera mostów dwusiarczkowych, odpowiada w części środkowej spirali, w roztworze może jednak dość łatwo ulegać zmianom konformacyjnym, co prawdopodobnie ma znaczenie w interakcji hormonu z właściwym receptorem. W roztworach stężonych pojedyncze cząsteczki glukagonu łączą się w trimery i w tej postaci występuje on w kryształach.