Ten typ próby polega na pobudzeniu przez tolbutamid komórek B wysp trzustkowych do zwiększonego wydzielania insuliny, a w jej ocenie uwzględnia się szybkość i stopień zmniejszenia glikemii po podaniu testowej dawki leku. Obecnie powszechnie stosuje się próbę dożylnego obciążenia solą sodową tolbutamidu. Po oznaczeniu glikemii na czczo wstrzykuje się szybko — w ciągu 2—3 min — osobom dorosłym 1,0 g tego leku (1 ampułkę Rasinon Hoechst), po czym oznacza ponownie glikemię w 20, 30, 40, 60, 90 i 120 min. Dzieciom podaje się tolbutamid w dawce 20 mg na kg masy ciała. U osób zdrowych poziom glikemii obniża się w 20 min poniżej 80% wartości wyjściowej, a w 30 min poniżej 77% wartości wyjściowej, po czym stopniowo narasta, osiągając lub przekraczając 80% wartości wyjściowej w 2 h testu. Ponieważ wynik próby zależy od wieku, zaproponowano zmodyfikowane, a zarazem uproszczone kryterium oceny wyniku testu, uwzględniające ten czynnik: prawidłowo maksymalne zmniejszenie glikemii dochodzące do lub poniżej 77% wartości wyjściowej występuje u dzieci w 20 min testu, u ludzi dorosłych w wieku 21—60 lat w 30 min, a u ludzi starych w wieku powyżej 60 lat w 40 min testu. W cukrzycy z zachowaną czynnością wydzielniczą komórek B (typ 2) zmniejszanie się glikemii jest powolne, mniej nasilone w początkowym okresie próby i trwa do końca testu. Po dożylnym wstrzyknięciu tolbutamidu obserwuje się także charakterystyczne zmiany w zachowaniu się kwasów tłuszczowych w surowicy. U ludzi zdrowych po przejściowym zmniejszeniu stężenie WKT wzrasta znacznie powyżej wartości wyjściowej, co tłumaczy się wpływem hipoglikemii pobudzającej wydzielanie działających lipolitycznie kateeholamin (adrenaliny). U chorych na cukrzycę natomiast stężenie WKT w surowicy stopniowo zmniejsza się przez niemal cały okres testu i dopiero pod koniec nieco się zwiększa, nie osiągając wartości wyjściowej, Próba dożylnego obciążenia tolbutamidem cechuje się dużą swoistością, co jest wynikiem farmakokinetycznych właściwości pochodnych sulfonylomocznika, nie wydaje się jednak, aby była czulsza w sensie wczesnego rozpoznawania zaburzenia przemiany węglowodanów aniżeli próba doustnego obciążenia glukozą. Jest prosta w wykonaniu, jednak na jej przebieg wpływa w warunkach fizjologicznych wiele czynników, jak dieta, niektóre leki oraz poziom glikemii na czczo: interpretacja wyniku próby obciążenia tolbutamidem jest niemiarodajna, jeżeli glikemia wyjściowa wynosi 3,9 mmol/1 (70 mg%) i mniej. Obecnie jest rzadziej wykonywana dla oceny sprawności czynności wydzielniczej komórek B wysp trzustkowych, a jeżeli się ją przeprowadza, to najczęściej równocześnie oznacza się we krwi insulinę (IRI) i peptyd C. Próba dożylnego obciążenia tolbutamidem jest natomiast w dalszym ciągu bardzo przydatna w rozpoznawaniu wyspiaków hormonalnie czynnych, wychodzących z komórek B (insulinoma). W tych przypadkach po wstrzyknięciu tego leku może wystąpić głęboka hipoglikemia, niekiedy połączona z utratą przytomności. Dlatego w razie podejrzenia wyspiaka wydzielającego insulinę dożylny test obciążenia tolbutamidem należy wykonać w warunkach szpitalnych.